Héritière directe de la 315 S, la 335 S a fait ses premiers pas lors de la tristement célèbre Mille Miglia en 1957 avec Alfonso De Portago, qui a remplacé à la dernière minute Luigi Musso, souffrant. La voiture était en troisième position lorsqu’un accident tragique s’est produit à proximité de Guidizzolo, provoquant la mort de De Portago, de son copilote Edmond Nelson et de 14 spectateurs. Les nombreuses protestations qui ont fait suite à ce drame ont mis fin aux courses de vitesse sur route en Italie. La 335 S a également participé au 24 Heures du Mans, où elle a signé le meilleur temps au tour avec une vitesse moyenne supérieure à 190 km/h. Elle s’est par ailleurs emparée de deux premières places aux 1 000 km du Venezuela, contribuant à la victoire de Ferrari au Championnat du monde des constructeurs.